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affinitäts-tags: was ist das
Status: (Frage) beantwortet Status 
Datum: 21:08 Di 27.03.2007
Autor: sandmann0187

weiß jemand, was affinitäts-tags sind?
es geht um "purification of his-tagged proteins using Ni sepharose fast flow", also grob um die reinigung eines proteins mithilfe eines histidin-nickel-komplexes (ich weiß, ist seeeehr grob beschrieben).
das ganze wird mit 6*His-GFP gemacht

allerdings liegt mein problem nun darin, dass ich nicht richtig weiß, was so ein tag ist. ich les immer nur
"Hier geht es um die Tags selbst, um kleine Tags. Kleine Tags sind Polypeptide mit einer maximalen Länge von zwölf Aminosäuren oder 1,5 kDa Größe. Hierzu zählen: Das Arg-Tag, c-Myc-Tag, Flag-Tag, His-Tag und Strep-Tag."  

so als beispiel.
heißt das, dass diese tags einfach nur polypeptide sind, die die löslichkeit aufgrund des aufbaus eines komplexes verändern, oder steckt da "mehr" dahinter.
weil letztendlich wird ja das ausgenutzt

        
Bezug
affinitäts-tags: Antwort
Status: (Antwort) fertig Status 
Datum: 03:17 Mi 28.03.2007
Autor: Fremdgaenger

Zuerstmal sind "affintiaets-tags" Denglisch ;-) . Aber gut, kommt man wohl nicht drumherum, fuer tag gibt es einfach keine anstaendige deutsche Uebersetzung :-) . Ich bleibe trotzdem lieber bei "affinity tags" oder einfach "tags" - das meint also im folgenden Text alles das gleiche.

"tag" steht im Englischen u.a. fuer "Anhaenger" oder "Etikett". Ein rekombinates Protein wird auf diese Weise fuer die Reinigung "markiert". Jedes tag hat seine spezifischen Eigenschaften. Das his(tidin)-tag kann zweiwertige positive Ladungen reversibel binden (beispielsweise Nickel, was oft zum Einsatz kommt), Arginin traegt eine Amino-Gruppe und bindet daher bevorzugt negativ gelandene "Gegenueber". Das erwaehnte flag-tag ist noch deutlich "sensitiver" als das his- und das arg-tag, die beide nur nach Ladungsverhaeltnissen trennen, waehrend das flag-tag mit einem Antikoerper reagiert.

Wenn das "Gegenueber" selbst irgendwo fixiert ist, z.B. an einem festen Traegermedium (bspw. einem Gel wie Sepharose), bleiben die Proteine mit tag haengen (in der Regel in einer Chromatographie-Saeule), waehrend (fast) alles andere "vorbeirauscht".
Das Loesen der Bindung ist auch nicht schwer: Man aendert die Umgebungsbedingungen so, dass etwas anderes den einen Bindungspartner "abschirmt". Oft nimmt man dazu einfach grosse Mengen an Salzen. Dann loest sich das Protein (und alles andere, was noch so gebunden ist) wieder und kann "eluiert" werden. Wenn man dann noch eine Moeglichkeit hat, auch diesen dritten Partner wieder zu loesen, kann man das System sogar mehrmal verwenden (das wird dann als "Reaktivierung" bezeichnet).

Der Kern des tagging ist also das spezifische Erkennen bestimmter "Muster", die moeglichst nur das interessierende Protein aufweist. Diese "Muster" fuehren zunaechst zu einer Bindung, die dann spaeter wieder geloest werden kann, um ein reines Protein zu bekommen. Saeulenchromatographie mit solchen tags haben oft eine sehr hohe Reinigungswirkung und sind entsprechend beliebt.

Ich hoffe, ich habe jetzt nicht nur weitere Verwirrung gestiftet... :-o
Gruesse vom Fremdgaenger

Bezug
                
Bezug
affinitäts-tags: danke
Status: (Mitteilung) Reaktion unnötig Status 
Datum: 07:36 Mi 28.03.2007
Autor: sandmann0187

danke für die ausführliche antwort.
verwirrt bin i nich mehr als vorher ;-]
aber die erklärung ist sehr gut.

lg

Bezug
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